第6章 - 輸送および動態 C：酵素阻害モデルの 生化学 - DR。 JAKUBOWSKI 2014年6月12日 クラスの後、実験室：章6Cの目標/目的を学びます。 この読書、学生のことができるようになります 結合された化学平衡式を書き、E、S、間の分子間相互作用を示す漫画を描くことで、競争力の競争、および可逆、非共有結合阻害剤による酵素の混合阻害区別、と私。 ルシャトリエの原理と結合された化学平衡式を使用して、二重逆数（ラインウィーバー・バークプロット）を描画し、酵素の片対数プロットは、異なる固定の阻害剤の濃度と酵素の活性化剤の存在下で触媒反応 結合された化学平衡と二重逆数プロットから、競争力の競争、および混合阻害のためにKであり、K IIを定義します。 見かけと実際の解離区別は二重逆数プロットから阻害剤と酵素の定数を定数と初期速度数学の方程式を方程式。 酵素とその阻害剤との類似から、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、および混合（非競合的拮抗薬）を定義します。 pHの変化は、酵素の活性に影響を与え、それぞれキロとKCATにどのような影響を与えるかを示唆している可能性があり、さまざまな方法について説明します。 すでにタンパク質の構造について知っていることを考えると、それは酵素を阻害する方法を理解するのが容易であるべきです。 構造機能を媒介するので、かなりの酵素の構造が変更されるものは、酵素の活性を阻害するであろう。 それが適切にリフォールディングができない限り、したがって、酵素を変性させることができますすべてがpH及び高温の両極端は、不可逆的な方法で酵素を阻害するであろう。 あるいは、我々は、その立体構造を変更したり、直接基質結合を防止するために、いずれかの酵素と非共有結合的に相互作用する小分子を追加することができます。 最後に、我々は、それらが共有結合、酵素活性に不可欠である場合、酵素を不可逆的に阻害することは、特定の側鎖を修飾することができました。 共有阻害 我々は以前、化学的に酵素活性のために重要であるかもしれない特定の側鎖を修飾することになる試薬の種類について議論しました。 Cys側鎖が活性に必要とされる場合、例えば、ヨードアセトアミドは、酵素活性を消失することがあります。 これらの試薬は、通常、しかし、いくつかの側鎖を変更し、基質の結合又は触媒変換のために重要であるかを決定することは困難であることができます。 一つの方法は、活性部位で可逆的に結合するリガンドの飽和量と活性部位を保護することです。 次に、化学修飾は、様々な反応時間で行うことができます。 重要な側鎖を化学修飾から保護されるが、保護の範囲は、Kdは、保護リガンドの濃度に依存します。 そして反応の長さ。 非共有結合阻害の種類 A. 競争 基板（S）および阻害剤（I）は、酵素上の同じ部位に結合し、両方の時に競合阻害が発生します。 実際には、それらは相互に排他的な方法で活性部位と結合するために競います。 これは、化学反応式と、以下の分子漫画に示されています。 同じ動的データを与える阻害の別のタイプがあります。 Sと私は別のサイトにバインドされ、SはEに結合し、Eの構造変化など、私がバインドできなかったこと（およびその逆）を製造した場合、Sの結合と私は相互に排他的であろう。 これは、アロステリック競合阻害と呼ばれています。 阻害試験は、通常、私のいくつかの固定と非飽和濃度と様々なS濃度で行われます。 理解するための重要な動力学的パラメーターは、Vmとキロです。 私たちは、私は定数Kは解離して、可逆的に結合し、Eへの迅速な平衡と方程式の導出を容易にするために仮定しよう。 ＆QUOT; S＆QUOT; 添字＆QUOTで、I S＆QUOT; y切片が一定しながら、1 / V 1 / Sラインウィーバー・バークプロット対のSロペが変わることを示しています。 Kはまた、K IC添字＆QUOTという名前が付けられています。 C＆QUOT; C ompetitive阻害定数の略です。 トップメカニズムを見ても、私の存在下で、無限大にSが増加すると、すべてのEが、ESに変換されていることを示しています。 それは私が結合することができるの空きEが存在しない、です。 今そのVM = K猫のE Oを覚えています。 これらの条件の下では、ES = E oを。 したがって、V = Vmと。 Vmが変更されません。 しかし、明らかキロ、キロのアプリ。 変更されます。 私たちはこのことを理解するためにLaChatelierの原理を使用することができます。 私は一人でEに結合し、ないES場合は、E + S＆LTの平衡をシフトします。==＆GT; キロアプリを増やすの影響だろう左にES（すなわち、それは、EとSの親和性が低下していると思われます。）。 二重逆数プロット（ラインウィーバーバークプロット）は阻害を視覚化するのに最適な方法を提供しています。 私の存在下で、Vmが変化しませんが、Kmが増加すると思われます。 したがって、1 /キロ、プロット上のx切片は、そのためのプロットを小さくし、0に近づくだろうと同じY切片（1 / VM）、およびXのintecepts（と、一連のラインで構成されています - 私が増加するにつれて1 /キロ）近いと0に近いです。 これらの交差プロットは、競合的阻害の特徴です。 このセクションで説明する最初の三つの阻害モデルで、ラインウィーバー・バークプロットは、阻害剤の存在下および非存在下で線形であることに注意してください。 これは、それぞれの場合におけるS対Vのプロットは、双曲線である、潜在的に異なる見かけVmとキロ値でそれぞれ、ミカエリスメンテン式の通常の形式に適合することを示唆しています。 上記の図に示す式は、反応の速度に対する競合的阻害剤の効果を示して導出することができます。 唯一の変更は、キロ項因子1 + I /キシュが乗算されることです。 したがってキロアプリ=キロ（1 + I /キシュ）。 これは、我々が予測されるように見かけのKmは増加しないことを示しています。 Kは私nhibitorは、二重逆数プロットのSロペに影響を与え、一定した阻害剤の解離です。 ウルフラムMathematicaのCDFプレーヤー - S対競合阻害V（無料のプラグインが必要） 4/6/14のWolfram MathematicaのCDFプレーヤー - 競争阻害 - ラインウィーバーバーク（無料のプラグインが必要） データがログS対VOとしてプロットした場合、我々は章5（b）のログL対MLのプロットのために見たように、プロットは、S字状になります。 競合阻害剤の場合には、阻害剤の異なる固定濃度の存在下でログのS対VOのプロットは、S字状の曲線の一連の同じVMを持つが、異なる見かけのKm値（キロアプリ=キロでそれぞれ構成されます （1 + I /キシュ）、徐々に右にシフトEnyzme動態データはほとんどこのようにプロットされませんが、M + L＆LTのための単純な結合データされる;で異なる阻害剤濃度の存在下で、ML平衡; ==＆GT。 単純な結合平衡の議論を再検討し、M + L＆LT; ==＆GT; ML。 我々はバインドされているどのくらい知っている、または小数飽和したい場合には、ログLの関数としては、3つの例を検討しました。 Kd = 100Lことを意味し、L = 0.01のKd（KdはすなわちL＆LT;＆LT）。 そして、Y = L / [Kdの+のL] = L / [100L +のL]≈1/100。 L = 0.01 Kdを、次にY≈0.01場合、これは、それにかかわらず実際の[L]の暗示します。 そのKdを= L / 100を意味し、= 100のKd（KD;＆GTすなわちL＆GT）、L。 L = 100 Kdは、その後、Y≈1なら、Y = L / [Kdの+のL] L / [（L / 100）+ L] = = 100L / 101L≈1.これは、そのかかわらず、実際の[L]の暗示します 。L = Kdは、その後、Y = 0.5 または、ログ観点から、これらのシナリオは、もしLが大きさの4以上のご注文（;;のKd＆LT 100KD 0.01Kd＆LT）を変化することを示します -2 +のKd＆LTを記録。 ログのKd＆LT; 1 - 2 +かかわらず、Kdをの大きさ、Yは約0から変化すること、のKd）を記録します。 Lはしたがって、+ 2で、ログのKdから変化した場合、他の言葉では、Yは0-1から変化し、ますます高いのKd（低親和性）の結合反応の一連のログ・L対Yのプロットは、同一のS字状曲線のシリーズを明らかにする 以下に示すように、右方向に徐々にシフトしました。 同じことは、最初のフラックスのために、競合阻害剤の異なる濃度の存在下でのS対VOの真になるのJ（L対またはY）、L対対競合阻害剤の存在下で外リガンド、またはML O 競合的阻害剤の存在。 ウルフラムMathematicaのCDFプレーヤー - ログ対競合阻害V（無料のプラグインが必要） LNSは単純な結合プロットのために述べたように、視覚的に、S対V 0のプロットよりも、解釈するのが容易である対多くの点ではV 0のプロットは、双曲線の教科書のイラストは、多くの場合、あまりにも速く、[Sの関数として横ばい曲線を示す、misdrawnされています ]それは飽和が達成されたかどうかを確認することは容易であるLNS対V 0のプロットと比較して。 また、様々な固定阻害剤濃度で、または変異体酵素形態のためのショー上記の曲線、LNS対V 0の複数の完全なプロットとしてLNSの広範囲（異なるアイソフォーム、サイト固有の変異体は）との比較を容易に行うことができます これらの異なる条件の下で実験的動態。 Km値が大きく異なる場合、これは特に当てはまります。 今、あなたは、バインディング、フラックスに精通しており、酵素反応速度曲線は、阻害剤の存在下および非存在下では、結合、初期フラックス、または初期速度がでプロットされる阻害曲線に上記の分析を適用することができるはず リガンドまたは基質の異なる固定された濃度の非飽和濃度での競合的阻害剤の濃度を変化させます。 酵素の活性を検討してください。 基板のいくつかの合理的な濃度（無限ではない）で、酵素は、約100％活性であると言うことができます。 競合阻害剤が添加されている場合は、酵素の活性が（無限）私が飽和にまで落とすだろう、全く活性が残っていないだろう。 これを示すグラフを以下に示します。 図：酵素活性の阻害 - ログ対％の活性[阻害剤] 競合阻害の特殊なケース：特異性定数：前の章では、特異性定数は、我々はまた、EとS、S＆LTの二分子反応に関連する第2次速度定数として記述のk cat / KMと定義した;＆LT ; K M。 また、酵素は異なる基質とを区別しているどのように良い説明しています。 酵素は、2つの基質を検出したがある場合は、一方が他方の競合的阻害剤であると考えることができます。 以下の導出は、同じ濃度での2つの競合する基質に対する初期速度の比は、それらのk cat / KM値の比に等しいことを示しています。 Javaアプレット：競合阻害私。 競合阻害II 競争力のないB. 不競合阻害が、私は自由だけESに結合していないときE. 一つは、S結合であることを仮定することができます発生し、Eの構造変化は、ESIは、製品を形成することができないので、I. 阻害のための結合部位が発生し提示するが発生します。 これは、ESに戻るには、一つだけの運命を持っている行き止まり複合体です。 これは、化学反応式と、以下の分子漫画に示されています。 私たちは、私は解離定数K IIとESに可逆的に結合する式の導出を容易にするために仮定しよう。 第二＆QUOT; I＆QUOT; で添字＆QUOT;私I＆QUOT; 傾きが一定しながら、1 / V 1 / Sラインウィーバー・バークプロット対のI nteceptが変わることを示しています。 K IIはまた、K iをuの名前が付けられています。 ここで、添字＆QUOT; U＆QUOT; U ncompetitive阻害定数の略です。 トップメカニズムを見てみると、Sが無限大に増加するにつれて、私の存在下で、Eの全てではないが、ESに変換されていることを示しています。 それは、ESIの有限量があっても無限S. であり、今の場合oをVmと=のk cat Eということを覚えているし、すべてのEは、フォームESである場合のみ。 これらの条件下で、明らかVmは、Vmのアプリは、阻害剤なしの本物のVMよりも小さいです。 また、明らかキロ、キロのアプリ。 変更されます。 私たちはこのことを理解するためにLaChatelierの原理を使用することができます。 私はEを一人でESに結合し、そうでない場合は、E + S＆LTの平衡をシフトします。==＆GT; 右にES。 キロアプリを減少の影響を持っていることになる（すなわち、それは、EとSの親和性が増加していると思われます。）。 二重逆数プロット（ラインウィーバーバークプロット）は阻害を視覚化するのに最適な方法を提供しています。 私の存在下では、Vmとキロメートルの両方が減少します。 したがって、-1 /キロ、プロット上のx切片は、より負取得し、1 / Vmがより肯定取得します。 それは、同じ程度に変化することがわかります。 したがって、プロットは、非競合的阻害の特徴である一連の平行線で構成されます。 上の図に示されている式は、反応の速度に非競合的阻害剤の効果を示して導出することができます。 唯一の変化は、分母のS期は、係数1 + I /紀伊乗算されることです。 我々はキロとVMが明らかではない阻害剤ではなく、S、の影響を受けているかを示すために、この式を再配置したいと思います。 上記のように式を整理すると、キロアプリ=キロメートル/（1 + I /紀伊）とVMアプリ= VM /（1 + I /紀伊）ことを示しています。 これは、我々が予測されるように見かけのKmおよびVmが減少しないことを示しています。 K IIは、私nhibitorは、二重逆数プロットのI nterceptに影響を与え、一定した阻害剤の解離です。 私がゼロの場合、キロとVmが変更されないことに注意してください。 Javaアプレット：非競合的阻害 ウルフラムMathematicaのCDFプレーヤー - S対非競合阻害V（無料のプラグインが必要） 4/6/14のWolfram MathematicaのCDFプレーヤー - 非競合阻害 - ラインウィーバーバーク（無料のプラグインが必要） 非競合C. 私はEとESの両方に結合する非競合的阻害が起こります。 私たちは、EとESの私の解離定数が同一であるだけ特殊なケースを見ていきます。 これはnoncompetiive阻害と呼ばれています。 それはしかし、EとESの両方を持つプロトンの共有結合相互作用は、非競合的阻害につながることができますEにSの結合に影響を与えない結合基質の代謝回転を阻害する大きな阻害剤を想像することは困難であるように、それは非常にまれです。 より一般的なケースでは、のKdのは異なり、阻害は、混合と呼ばれています。 阻害が発生するので、我々は、ESIは、製品を形成することができないと仮定します。 これは、ESまたはEIに戻るには、一つだけの運命を持っている行き止まり複合体です。 この化学式において、以下の分子漫画に示されています。 （私たちは競争阻害に述べたように）私たちは（私たちは競争力の阻害に示すように）私は、Kの解離定数であるとEに可逆的に結合する式の導出を容易にするために想定し、解離定数K IIとESにしましょう。 キシュは紀伊を=非競合的阻害のために想定しています。 トップメカニズムを見てみると、Sが無限大に増加するにつれて、私の存在下で、Eの全てではないが、ESに変換されていることを示しています。 それは、ESIの有限量があっても無限S. であり、今の場合oをVmと=のk cat Eということを覚えているし、すべてのEは、フォームESである場合のみ。 これらの条件下で、明らかVmは、Vmのアプリは、阻害剤なしの本物のVMよりも小さいです。 これとは対照的に、明らかキロ、キロのアプリ。 私は同じ親和性でEとESの両方に結合するので、変更されません、従ってLaChatelierの原則から推定されるように、その均衡を乱すことはありません。 二重逆数プロット（ラインウィーバーバークプロット）は阻害を視覚化するのに最適な方法を提供しています。 私の存在下で、ちょうどVmが低下します。 したがって、-1 /キロ、x切片は同じままになり、1 / Vmがより肯定取得します。 したがって、プロットは、非競合的阻害の特徴であるx軸、上交差する一連のラインで構成されています。 あなたはキシュが紀伊（混合阻害）と異なる場合のプロットがどのように表示されるかを把握することができるはずです。 上記導出することができる図に示す式は、反応の速度に非競合的阻害剤の効果を示します。 分母では、キロは、1 + I /紀伊によって1 + I /キシュ、およびSが乗算されます。 我々はキロとVMが明らかではない阻害剤ではなく、S、の影響を受けているかを示すために、この式を再配置したいと思います。 上記のように式を整理すると、キロアプリ=キロ（1 + I /キシュ）/（1 + I /紀伊）=キロ時キシュ=紀伊、とVMアプリ= VM /（1 + I /紀伊）ことを示しています。 これは、Kmは不変であると私たちは予測されるようにVmが減少することを示しています。 プロットは、x軸に交差する一連の線を示しています。 どちらの傾きとy切片は、2つの解離定数の名前に反映され、変更された、Kがあり、K II。 私がゼロの場合、キロアプリ=キロとVMアプリ= Vmのことに注意してください。 時々キシュと紀伊阻害解離定数をKcをとKu（競争力と競争阻害解離定数と呼ばれています。 ミックス（および非）（上記のメカニズムによって示されるように）競合阻害が、その中で競争力とuncompetiive阻害異なるインクルードは、結合阻害剤、単に阻害剤は、単一の逆の手順で解離可能なデッドエンド反応ではありません。 上記の平衡で、Sはシステムが平衡状態でないかもしれないので、EIを形成するために、ESIから解離することができます。 デッドエンドステップの平衡が乱されないようにデッドエンドのステップでは、反応物のないフラックスはデッドエンド複合体を介して発生しません。 他のメカニズムは、一般的に混合阻害を与えることができます。 例えば、（次の章で説明）ピンポン機構にリリースされた製品は、混合阻害を与えることができます。 Pは、製品の阻害剤として作用し、酵素（E 'およびEも）の2つの異なる形態に結合することができる場合には、混合阻害剤として作用します。 Javaアプレット：非競合的阻害 4/26/13のWolfram MathematicaのCDF Playerの - Sカーブ対混合阻害V; KISと紀伊は呼ばKcのとKu（高い値でスライダを開始）（無料のプラグインが必要） 4/26/13のWolfram MathematicaのCDF Playerの - Sカーブ対混合阻害V（高い値にスライダーを開始）（無料のプラグインが必要）。 阻害さと抑制さ曲線はキシュと紀伊の異なる値で交差する場所に注意してください（グラフにKcをおよびKuと呼ばれます）。 あなたがLeChatilierの原則を適用できる場合は、阻害のいずれかのシナリオ、あるいは逆の場合、酵素活性化のためのラインウィーバー・バークプロットを描画することができるはず！ in vitroでの酵素阻害 全体の製薬産業は、生物学的プロセスに影響を与える薬物分子を見つけることに専念しています。 最近の研究は、DNAの転写およびmRNAの翻訳に影響を与える阻害性RNA分子の開発に拡大しているが、通常、これは、標的タンパク質の小分子阻害剤の開発を意味します。 コンビナトリアル合成技術および計算モデルを用いて、精製された酵素、基質、および実験室試験において阻害剤を用いてインビトロでタンパク質を阻害する小分子阻害剤（特に、競争力のあるもの）を開発することが容易に得ています。 阻害剤が膜を通過し、十分な十分な濃度に蓄積することができると仮定すると、それは、試験管のような細胞内で同じ阻害特性を持っているでしょうか？ 答えは多分であることが判明しました。 セルはしっかりと他の小分子と高分子の多くが詰め込まれていることを覚えておいてください。 また、阻害のために標的酵素は、酵素に反応物を供給し、製品を削除する酵素の経路の一部に最も可能性が高いです。 標的酵素の生成物濃度は、酵素の速度論的パラメータと利用可能な基質の濃度によって決定されるが故に基質および生成物のフラックスは、全経路だけではなく、単一の標的酵素によって制御されます。 酵素が検討される条件（インビトロ）及び（生体内で）動作は非常に異なっています。 基板を変化させながら、インビトロで（実験室で）、酵素（すなわち基質濃度が独立変数である）一定の濃度に保たれます。 速度は基質濃度によって決定されます。 阻害を検討したときの阻害剤は、いくつかの異なる固定された濃度で一定に保持したまま、基板を変化させます。 インビボ（細胞内）、速度は速度によって決定される基板と比較的一定のレベルに保持されることがあります。 酵素は、マイケル・メンテン式によって決定される生成物を生成するために、定常状態のやり方でそれを処理するように磁束のボトルネックを回避するために、基質は、酵素で構築することができません。 阻害剤は、生体内で追加されたときに何が起こります。 酵素は、V = VM / 2で実行されていることを仮定しよう。 我々は、それが（本当の、架空のない完璧な二重逆数プロットから証明されるように）競争力とuncompetiive阻害を区別することが困難な場合があるインビトロ阻害のために前に見ました。 IとSの両方を変えることができ、ここで経路の途中で酵素のSはVによって決定されたときにどのようにin vivoで阻害プロットは、（たとえば、V = VM / 2）一定速度で見えるかもしれませんか？ 方程式と下のグラフは、一定のVで阻害するためのI / KのIX、代謝経路中の酵素は、全体の経路によって課さコントロールを束に対象となる場合に遭遇する条件VS S /キロの比率を示しています。 x軸は、その阻害定数と比較して、阻害剤の相対量を反映します。 同様に、y軸は、そのキロに比べて基板の相対量を反映しています。 in vivoでの競合阻害するためのグラフは直線的であるが、それ＆QUOT;アップ＆QUOTを吹きます。 競争阻害のために。 図：in vivoでの競争力と非競合的阻害 ContantをVで競合阻害